Em 2006, Beyoncé continuou a sua carreira no cinema ao co-estrelar o filme A Pantera Cor-de-Rosa no papel de Xania, uma pop star internacional, acompanhada do ator americano Steve Martin, que interpreta o policial Jacques Clouseau. O filme foi lançado em 10 de fevereiro de 2006, e estreou em primeiro lugar nas bilheterias, fazendo 21,7 milhões dólares em vendas de ingressos em sua primeira semana. Beyoncé gravou a música "Check on It" para a trilha sonora do filme, junto com o rapper Slim Thug; a canção alcançou o primeiro lugar na Billboard Hot 100.
Em 2005, o lançamento do seu segundo álbum foi cancelado por ter ganhado um papel no filme Dreamgirls, uma adaptação cinematográfica de 1981 do sucesso da Broadway sobre um grupo de canto da déc. de 1960, vagamente baseado no grupo feminino The Supremes da gravadora Motown. No filme, ela interpreta Deena Jones, baseada em Diana Ross. Em entrevista para a revista Billboard, Beyoncé disse:
Não vou escrever nenhuma música para o meu álbum, até terminarem as gravações do filme. — Beyoncé fala sobre o seu segundo album de estúdio.
Em dezembro de 2006 o filme foi lançado, com Jamie Foxx, Eddie Murphy e Jennifer Hudson no elenco do filme. Beyoncé gravou várias músicas para a trilha sonora do filme, incluindo a música "Listen". Em 14 de dezembro de 2006, Foi nomeada para duas categorias no Globo de Ouro: Melhor atriz em um filme, comédia ou musical e Melhor canção original por "Listen".
Numa entrevista para o MTV News, Beyoncé disse:
Me inspirei no meu papel em Dreamgirls, para criar o meu segundo álbum. Depois que as gravações do filme acabaram, eu tinha tantas coisas guardadas, tantas emoções, tantas idéias. — Beyoncé fala sobre o álbum B'Day em uma entrevista para a MTV.
Beyoncé trabalhou com colaboradores de músicas do seu primeiro álbum, como Rich Harrison, Rodney Jerkins e Sean Garrett. Ela co-escreveu e co-produziu quase todas as canções incluídas no álbum, que ficou pronto em três semanas.
B'Day foi lançado mundialmente em 4 de setembro de 2006 e 5 de setembro de 2006 nos Estados Unidos, para coincidir com a data do seu aniversário de 25 anos de idade. O álbum estreou em primeiro lugar na Billboard 200, vendendo mais de 541 mil cópias na primeira semana, tornado-se sua maior marca de vendas como artista solo. O álbum foi certificado 3x platina nos Estados Unidos pela RIAA. O álbum teve o seu primeiro single "Déjà Vu" em primeiro lugar no Reino Unido; a música tem a participação do rapper Jay-Z. A música "Irreplaceable" foi lançada como o segundo single do álbum em Outubro de 2006, nos Estados Unidos o single foi lançado como o terceiro single do álbum. "Irreplaceable" permaneceu por 10 semanas consecutivas na Billboard Hot 100, se tornando uma das músicas bem sucedidas de Beyoncé na Billboard.
Foi lançada uma versão Deluxe do trabalho no dia 3 de abril de 2007. Ele trouxe cinco novas faixas e a versão em espanhol das músicas "Irreplaceable" e "Listen". Junto com o álbum, foi lançado também o DVD B'Day Anthology, que contém dez videoclipes. No dia 10 de abril de 2007, Beyoncé iniciou a sua segunda turnê solo The Beyoncé Experience Tour, visitando mais de noventa casas de show em todo o mundo. Um álbum ao vivo com um show dessa turnê foi gravado: The Beyoncé Experience: Live. No Grammy Awards de 2007, B'Day ganhou o prêmio de Melhor Álbum de R&B Contemporâneo. Beyoncé se tornou a primeira mulher a ganhar o prêmio de Artista Internacional no American Music Awards.